Román Martí Diaz¹, JUAN CABEZAS HERRERA², MARIA FERNANDA MONTENEGRO ARCE³, Rebeca González Guerrero¹, JOSE NEPTUNO RODRIGUEZ LOPEZ², Luis Sánchez del Campo Ferrer¹

(1) Departamento de Bioquímica y Biología Molecular A. Universidad de Murcia, 30100, España (Región de Murcia)
(2) TERAPIAS MOLECULARES Y BIOMARCADORES DE TUMORES SÓLIDOS, IMIB, España
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El melanoma es un tipo de cáncer con una gran capacidad de invasión que, con frecuencia, puede producir la muerte. El conocimiento de determinados genes reguladores maestros en el desarrollo, diferenciación, proliferación y supervivencia celular ofrece una alternativa en las futuras terapias para el tratamiento del cáncer. Un ejemplo de este tipo de genes maestros en melanoma es el Factor de Transcripción Asociado a Microftalmia (MITF). En este contexto, una mejor comprensión de los mecanismos inmunes, asociados con el establecimiento del melanoma, así como el hecho de que la radiación ionizante afecta al microambiente tumoral ha conducido al desarrollo de nuevas estrategias para el tratamiento de esta patología, como, por ejemplo, el uso de la radioterapia en combinación con la inmunoterapia.

Los principales métodos utilizados en este trabajo incluyen: Cultivos celulares, ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), ensayos de luciferasa, Western-Blot, ARN interferente, cuantificación de ARNm por RT-qPCR, cuantificación de proteínas mediante ELISA.

El análisis de la secuencia del promotor de ADAM10, reveló la presencia de una secuencia consenso E-Box (CACGTG), 262 pares de bases antes del inicio de la transcripción. Datos disponibles de experimentos de ChIP-Seq para MITF en distintas células de melanoma mostró la presencia de MITF en el promotor de ADAM10. Los estudios de RNA-Seq en muestras de melanoma muestran una correlación positiva entre la expresión de MITF y ADAM10. Experimentos de inmunoprecipitación de cromatina en líneas de melanoma confirmaron la unión de MITF al promotor de ADAM10 en el contexto de la cromatina de las células de melanoma. Mediante ensayos de luciferasa transfectando células HEK293 con un plásmido que contenía la región del promotor de ADAM10 revelaron que MITF tiene un efecto directo en la transcripción de ADAM10. Ensayos tanto de Western-Blot como RT-qPCR mostraron que aquellas células con altos niveles de expresión de MITF se corresponden con altos niveles de ADAM10, mientras que en las células con niveles muy bajos de MITF, no se aprecia expresión de la proteína ADAM10. Experimentos encaminados a variar los niveles de expresión de MITF en las células tanto su silenciamiento como su sobreexpresión también confirmaron la regulación de ADAM10 por MITF. Se quiso también conocer el efecto de esta sobre la expresión de MITF. Experimentos de WB, citometría de flujo, RT-qPCR y microscopia confocal en distintas líneas de melanoma mostraron un aumento evidente de MITF tras 24-48 horas de irradiación con 10 Gy. Como era de esperar, el análisis de los niveles de MITF y ADAM10 mediante RT-qPCR, mostró un claro aumento en la expresión de ambas proteínas tras la irradiación. Aquellas muestras sometidas a irradiación puesto que se produce un incremento de MITF, acompañado de un aumento en la expresión de ADAM10, se reducen los niveles de MICA y MICB debido probablemente al corte proteolítico por ADAM10.

Aquí revelamos un vínculo interesante entre MITF y ADAM10, así como entre la radiación y la expresión de moléculas inmunológicas en membrana (MICA y MICB) de las células de melanoma. La regulación de la expresión de ADAM10 está mediada de forma directa a nivel transcripcional por la unión del factor de transcripción MITF al promotor de ADAM10. La irradiación ionizante en células de melanoma provoca un incremento en la expresión de MITF y por tanto también de ADAM10.