MARIA PIEDAD FERNÁNDEZ PÉREZ¹, ANA BELEN ARROYO RODRIGUEZ², NURIA GARCÍA BARBERÁ³, ASCENSION MARIA DE LOS REYES-GARCIA PASTOR³, Rebecca Hernández Antolín⁴, SONIA ÁGUILA MARTÍNEZ³, Vicente Vicente García³, Rocío González-Conejero Hilla³, CONSTANTINO MARTÍNEZ GÓMEZ³

(1)
(2) PATOLOGÍA MOLECULAR Y FARMACOGENÉTICA, IMIB, España
(3) HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL, IMIB, España
(4) Universidad de Murcia, España (Región de Murcia)

Los neutrófilos constituyen la primera línea de defensa frente a patógenos por varios mecanismos entre los que se incluye la NETosis. Nuestro grupo mostró que la deficiencia de miR-146a, un modulador negativo de la respuesta inflamatoria, favorece la formación de NET tanto in vitro como in vivo. Así, pacientes con fibrilación auricular portadores de rs2431697-TT (variante que transcribe el 50% de miR-146a) tienen más marcadores de NET en plasma, lo cual se asocia con mayor riesgo de eventos cardiovasculares. Recientemente, se ha descrito que los neutrófilos muestran una amplia diversidad fenotípica acompañada de importantes cambios funcionales. Por ello, investigamos si la mayor capacidad para formar NET de los neutrófilos deficientes en miR-146a puede estar asociada a un cambio fenotípico.

Se extrajo sangre periférica (SP) de ratones silvestres (WT) y miR-146a-/- en situación basal y tras 4 horas de la inyección intraperitoneal de LPS (1mg/Kg). Se midieron niveles de distintos componentes de los NET en el plasma de estos ratones: elastasa de neutrófilos (NE) mediante ELISA, DNA libre circulante (cfDNA) mediante SYTOX Green e Histona H3 citrulinada (H3cit) mediante western blot. Los marcadores Ly6G, CD11b, CD62L y Cxcr4 se midieron en neutrófilos de SP mediante citometría de flujo (2 experimentos; n=6 ratones/grupo) empleando un citómetro de flujo BD LSRFortessaTM X-20 (Becton-Dickinson).

Los ratones deficientes en miR-146a mostraron mayores niveles plasmáticos que los WT para todos los marcadores de NETosis analizados (NE, cfDNA y H3cit; Tabla 1) tras la inyección de LPS. Cuando comparamos basalmente los niveles de los marcadores de activación de neutrófilos comprobamos que los neutrófilos miR-146a-/- tenían niveles más elevados de CD11b (CD11bhigh) y más bajos de CD62L (CD62Llow) que los neutrófilos WT (Tabla 1). Sin embargo, al estimular con LPS ambos marcadores alcanzaron niveles similares, sugiriendo que la deficiencia en este miRNA confiere a los neutrófilos un estado pre activado. Además de estos dos marcadores, se ha descrito que un aumento de Cxcr4 (Cxcr4high) se asocia a un fenotipo envejecido. El análisis de este marcador a nivel basal reveló que los neutrófilos de ratones miR146a-/- tenían además un fenotipo Cxcr4high respecto a los WT (Tabla 1).

Los neutrófilos miR-146a-/- producen mayores niveles de NETs ante la estimulación con LPS. Además, el estudio preliminar del fenotipo de neutrófilos sugiere que la deficiencia de miR-146a-/- en neutrófilos murinos promueve la adquisición de un fenotipo “envejecido” caracterizado por los marcadores CD11bhigh CD62Llow Cxcr4high. Este fenotipo podría explicar la mayor capacidad de los neutrófilos deficientes en miR-146a para formar NET tal y como han sugerido algunos trabajos. En una siguiente aproximación nos planteamos estudiar la asociación entre el genotipo rs2431697 TT y el fenotipo “envejecido” en neutrófilos humanos lo cual, de confirmarse, podría tener un impacto en el manejo clínico de enfermos con distintas patologías cardiovasculares e inflamatorias. Financiación: PI17/0051, PFIS18/0045, CD18/00044 (ISCIII y FEDER), 19873/GERM/15 (Fundación Séneca), Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia (SETH), Premio López-Borrasca (SETH).