Lucía Hernández Cuesta¹, Ana María GARCÍA HERNÁNDEZ², Laura Martinez Alarcon³, Juana Maria Abellaneda CUADRADO³, MARIA MAR MOLINA MOLINA², DAVID GARCIA BERNAL⁴, José Antonio Campillo Marquina⁵, Isabel María García Guillén⁶, SANDRA LOPEZ CABALLERO⁷, Pablo Ramirez Romero³, Antonio Rios Zambudio³, Antonio Muñoz Luna³, Guillermo Ramis Vidal³

(1) Departamento de Producción Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 30100, España (Región de Murcia)
(2) PLATAFORMA SALA BLANCA, IMIB, España
(3) CIRUGÍA DIGESTIVA, ENDOCRINA Y TRASPLANTE DE ÓRGANOS ABDOMINALES, IMIB, España
(4) TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICO / TERAPIA CELULAR, IMIB, España
(5) INMUNOLOGÍA E INMUNOTOLERANCIA EN TRASPLANTES Y ENFERMEDADES DE BASE INMUNOLÓGICA, IMIB, España
(6) REGIONALIZACION CEREBRAL Y GENES DEL DESARROLLO, IMIB, España
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El microquimerismo es una estrategia ensayada para la generación de cerdos donantes en xenotrasplante. Se introducen células pluripotenciales humanas en los fetos antes del reconocimiento de propio y extraño lo que potencialmente generará tolerancia en el receptor. Se han estudiado las células utilizadas en la generación de lechones microquiméricos en 2010 (Abellaneda et al., 2010). Los objetivos fueron estudiar la viabilidad tras criopreservación prolongada y la caracterización de las células presentes en las muestras utilizadas en inyección in útero ecoguiada que produjo animales con hematíes con HLA-I en superficie hasta los 4 meses de vida en bazo y otros órganos (Figura 1).

Se estudiaron muestras de dos estirpes de células madre humanas: Mesenquimales aisladas de médula ósea (CSM-MO) y mononucleares totales de sangre de cordón umbilical (CMN-SCU). En el primer caso, se aislaron células adherentes a partir de muestras de médula ósea humana y e el segundo se aislaron células mononucleares totales mediante gradiente. Se descongelaron las células criopreservadas durante 10 años, se hicieron cultivos de expansión, de diferenciación a osteoblastos, adipocitos y clonogénico de las CSM-MO. Así mismo, a las CMN-SCU se le realizaron cultivos clonogénicos y aislamiento de mesenquimales. También se usó la técnica de citometría de flujo (CF) para detectar marcadores específicos de membrana y saber así su inmunofenotipo.

Se logró demostrar la viabilidad, capacidad de adhesión y capacidad de expansión en ambos tipos de células, aunque estuvieron criopreservadas durante 10 años. La viabilidad estuvo entre el 25-80% para las CMN-SCU y el 44-95% para las CSM-MO. Se consiguieron caracterizar e identificar mediante su inmunofenotipo por Citometría de flujo las diferentes poblaciones celulares las muestras estudiadas. Los cultivos de diferenciación fueron positivos para diferenciación a osteoblastos, pero negativos para adipocitos y precursores hematopoyéticos. Por el contrario, se lograron resultados positivos en todos los cultivos clonogénicos de las CMN-SCU, además de demostrar su viabilidad. En ambos casos se encontraron colonias hematopoyéticas, que potencialmente pudieron dar lugar a los hematíes con marcadores humanos que se encontraron en lechones inyectados con los dos tipos de células, aunque en el caso de las CSM-MO no superaron el 1% del total de células.

Las CMN-SCU se pueden diferenciar a células hematopoyéticas in vitro, siendo una buena fuente celular para lograr microquimerismo mixto hematopoyético prenatal. Las CSM-MO presentan una pequeña población de células madre hematopoyéticas en muestras de cultivos purificados. Estos resultados apoyan los resultados obtenidos de Abellaneda en 2016, donde se observaron hematíes humanos en muestras de cerdos microquiméricos inyectados con las células estudiadas.